Особенности определения резус-фактора и пола плода по материнской крови методом ПЦР, кому показан и когда его можно проводить?

Возможность пренатальной диагностики резус-фактора плода по крови беременной резус-отрицательной женщины

Особенности определения резус-фактора и пола плода по материнской крови методом ПЦР, кому показан и когда его можно проводить?
1 Маркелова А.Н. 1 Мельников В.А. 1 Тюмина О.В. 2 1 ГБОУ Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Самара2 ГБУЗ Самарской области «Клинический центр клеточных технологий», Самара Возможности пренатальной диагностики постоянно растут и  совершенствуются.

К одному из видов пренатальной диагностики можно смело отнести инновационное направление – неинвазивную пренатальную диагностику по крови беременной женщины. Это новый метод, который открывает широкие возможности для современной медицины.Определение резус-фактора плода по крови резус-отрицательной матери – наиболее хорошо изученная его часть.

Диагностика резус-фактора плода ранее вызывала затруднения и была возможна с 20 недели беременности путем амниоцентеза или кордоцентеза. Данная процедура опасно как для матери, так и для плода.

Благодаря новому инновационному методу неинвазивной пренатальной диагностики резус-фактора плода по крови матери удастся улучшить качество оказания медицинской помощи резус-отрицательным беременным женщинам и снизить процент резус-сенсибилизированных женщин в России. 1. Коноплянников А.Г.

Новые технологии в диагностике, лечении и профилактике гемолитической болезни плода и новорожденного: автореф. дис. … д-ра мед. наук. – М., 2009. – 48 с.
2. Маркелова А.Н., Тюмина О.В., Тороповский А.Н. Новый подход к ведению беременных женщин с резус-отрицательной кровью с ранних сроков беременности // Фундаментальные исследования. – 2011 – № 11 (Ч. 2) – С. 330–332.
3. Митря И.В.

Оптимизация методов профилактики, диагностики и лечения резус-сенсибилизации: автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 2010. – 21 с.
4. Современные методы диагностики, лечения гемолитической болезни плода и новорожденного при резус-сенсибилизации: пособие для врачей / Г.М. Савельева, М.А. Курцер, О.Б. Панина, Л.Г. Сичинова, Р.И. Шалина, П.А. Клименко, А.Г. Коноплянников и др.. – М.

: Изд-во МЗ РФ, 2004. – 28 с. 5. Сидельникова В.М. Гемолитическая болезнь плода и новорожденного. – М.: Изд-во «Триада-Х», 2004. – 192 с.
6. Bianchi D.W., Wiliams J.M., Sulivan L.M., Hanson F.W., Klinger K.W., Shuber A.P. PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploidy pregnancies. Am J Hum Genet 1997; 61: 822–829
7. Lo Y.M.D., Lo E.S., Watson N., NoakesL.

, Sargent I.L., Thiaganathan B., Wainscoat J.S.. Two-day cell traffic between mother and fetus: biologic and clinical implications. Blood. 1996; 88: 4390–4395.
8. Lo Y.M.D., Hjelm NM, Fidler C., Sargent I.L., Murphy M.F., Chambelain P.F., Poon P.M.K., Redman C.W.G., Wainscoat J.S..

Prenatal diagnosis of fetal RHd status by molecular analisis of maternal plasma National England journal of medicine. 1998; 339: 1734–1738.

В России процент резус-сенсибилизированных женщин достигает 1,2 % (Сидельникова В.М. и соавт. 2004; Савельева Г.М. и соавт., 2004). В развитых странах мира количество женщин c Rh-сенсибилизацией равно 0,1-0,2 %.

Столь низкий процент достигнут благодаря внедрению в клиническую практику специфической профилактики путем введения антирезус-иммуноглобулина несенсибилизированным резус-отрицательным женщинам. Разница в количестве сенсибилизированых женщин возникла по нескольким причинам, одна из которых – высокая стоимость антирезус-иммуноглобулина, покупать который приходится за свой счет. Хотя вводить данный препарат необходимо только тем резус-отрицательным беременным женщинам, чей плод является резус-положительным.

Вопреки мнению, что плацента образует барьер между матерью и ребенком, это не так (Loetal., 1996). Многочисленные исследования показали, что как целые клетки плода, так и внеклеточные фетальные ДНК проходят через плаценту и циркулируют в материнском кровотоке.

Интактные фетальные клетки, циркулирующие в материнском кровотоке, являются привлекательной мишенью для неинвазивной пренатальной диагностики, а именно для диагностики резус-фактора плода, пола плода и хромосомных аномалий путем простого кариотипирования.

Хотя существование фетальных клеток в материнской крови известно более века, непосредственно интактные фетальные ядерные красные кровяные клетки с целью пренатальной диагностики не использовались до 1990 года.

С этого времени выделение и обнаружение клеток плода из крови матери начали интенсивно исследоваться, и стали появляться различные методы выделения фетальных клеток, которые были в разной степени успешными. Однако результаты исследований были неутешительные.

Это было обу­- словлено недостаточностью интактных клеток плода, циркулирующих в материнском кровотоке (около 1 клетки в миллилитре материнской крови) (Bianchi и соавт., 1997), низкой эффективностью исследований (Bianchi и соавт., 1997).

Хотя некоторые клетки плода (в частности ядерные красные кровяные клетки плода) имеют сравнительно короткую продолжительность жизни в материнской крови, фетальные клетки других типов могут сохраняться в материнской крови десятилетия после беременности и потенциально способны вызвать ложноположительные результаты при последующих беременностях. Таким образом, несмотря на то, что современные исследования пытаются улучшить технику сортировки клеток, большинство последних научных исследований сосредоточены на бесклеточной ДНК плода в крови матери, которая представлена в достаточном количестве (Lo и соавт.1998).

Огромное количетво человеческой ДНК расположено внутри клетки, но присутствие небольшого количества вкДНК в циркуляции и здоровых, и больных женщин было открыто в 1947 г.

Хотя их биологический источник и потенциальная функция остаются неопределенными, предполагают, что это продукт апоптоза, в результате которого происходят фрагментация и выход хромосомных ДНК из клетки.

Присутствие ДНК плода в материнской циркуляции была продемонстрировано Lo и соавторами в 1998 году.

Фетальные ДНК образуются путем апоптоза плацентарных клеток (трофобласта), полученных от и составляют примерно 3-6 % от общих бкДНК в материнском кровотоке в начале и конце беременности соответственно (Lo и соавт. 1998) (оставшиеся 94-97 % составляют материнские вкДНК).

ДНК плода можно обнаружить с 4-й недели гестации, хотя надежно только с 8 недели концентрация его возрастает с увеличением гестационного возраста- от 16 фетальных геномов на миллилитре крови матери в первом триместре беременности до 80 в третьем триместре) -с острым пиком в течение последних 8 недель беременности (Lo и др., 1998). В отличие от фетальных клеток, вкфДНК быстро выводится из крови матери с периодом полураспада 16 мин и не определяется через 2 ч после родов.

Цель исследования - оценить метод неинвазивной диагностики резус-фактора плода по крови беременной женщины.

Материалы и методы исследования

Для определения резус-фактора плода была использована фетальная ДНК из плазмы крови беременной резус-отрицательной женщины. В исследовании принимали участие 150 беременных резус-отрицательных женщин. Были использованы образцы венозной крови объемом 7 мл. В каждом случае женщины подписывали информированное согласие.

Для выявления гена резус-фактора применялась ПЦР в реальном времени с использованием диагностических наборов для идентификации гена резус-фактора плода в крови матери «ДНК-резус ребенка» производства ООО «Ген-технология» (Россия, РУ № ФСР2010/09565).

Определение резус-фактора плода по крови беременной резус-отрицательной женщины основывается на том, что в плазме крови беременной женщины присутствует внеклетчная фетальная ДНК.

Для правильного определения резус-фактора плода по крови беременной женщины необходимо соблюдение следующих условий:

1. Срок беременности – с 10 недель.

2. Правильное обращение с плазмой, выделение ДНК в максимально быстрые сроки.

3. Выделение ДНК с использованием надёжной технологии.

4. Организация работы в ПЦР-лаборатории согласно действующим национальным нормам.

5. Чёткое следование инструкции.

Исследование проводится в несколько этапов:

1. Взятие крови и выделение плазмы. Исследуемым материалом для проведения анализа является венозная кровь беременной резус-отрицательной женщины.

Кровь сдаётся натощак, собирается в пробирку с антикоагулянтом EDTA в количестве 7-10 мл. В течение 24 ч с момента взятия крови следует отобрать плазму и перенести в новую пробирку.

Плазма должна доставляться в лабораторию в течение 16-24 ч после взятия материала.

2. Выделение ДНК. Проводится колоночно-адсорбционным методом с использованием рекомендуемых комплектов наборов, предназначенных для выделения циркулирующих нуклеиновых кислот из биологических жидкостей согласно методике производителя.

3. Проведение амплификации с детекцией в режиме реального времени. Пробоподготовка – стандартная для проведения ПЦР.

Подготавливаются реакции для непосредственного выявления гена резус-фактора в исследуемой пробе, а также контрольные реакции, подтверждающие правильность выполнения исследования.

Реакция занимает от 1,5 до 2 часов (в зависимости от скорости изменения температуры амплификатором).

4. Регистрация и учёт результатов анализа.

Результаты исследования и их обсуждение

Все 150 женщин, вступившие в исследование, были резус-отрицательные по результатам серологического анализа. Для 115 из них стал известен резус-фактор рожденного ребенка.

Резус-фактор рожденных детей оценивался серологическим методом в роддоме.

ДНК-анализ 76 образцов указал на положительный резус-фактор плода, в 39 случаях был установлен отрицательный резус-фактор. Результаты анализа были подтверждены анализом крови детей после их рождения. В одном случае результат анализа не совпал (при отрицательном резус-факторе по данным тест-системы фактический резус-фактор оказался резус-положительным).

Следует отметить, что срок беременности для этой пациентки составил 9 недель, в то время, как минимальным сроком, гарантирующим правильность результатов анализа, является срок 10 недель. Следовательно, данный результат не может использоваться при оценке аналитических характеристик тест-системы. У двух детей резус фактор был определен неправильно в роддоме.

После полученния результата анализа на определение резус-фактора этих детей, не совпадающего с нашими результатами, у них был взят буккальный соскоб и проведено генетическое определение резус-фактора. Результат данного анализа подтвердил правильность определеного нами резус-фактора плода по крови беременной женщины.

1,8 % (2 ребенка) – неправильное определение резус-фактора детей в роддоме

Таким образом, чувствительность и специфичность применяемого метода диагностики составили 100 %.

Выводы

- новые диагностические наборы для идентификации гена резус-фактора (RHD) «ДНК-резус ребенка» российского производства можно рекомендовать для внедрения в медицинскую практику акушерам-гинекологам для ранней неинвазивной диагностики резус-фактора по крови беременной женщины;- определение резус-фактора на раннем сроке беременности позволяет избежать дорогой медикаментозной профилактики;

- введение антирезус-иммуноглобулина всем резус-отрицательным женщинам, беременным резус-положительным плодом, в дальнейшем приведет к снижению процента резус-сенсибилизированных женщин в России.

Рецензенты:

Шатунова Е.П., д.м.н., доцент, заведующая отделением гинекологии Клиник Сам ГМУ, г. Самара;

Шляпников М.Е., д.м.н., доцент, зам. главного врача по акушерству и гинекологии ММБУ ГКБ№ 2 им. Н.А. Семашко, г. Самара.

Работа поступила в редакцию 17.10.2012

Библиографическая ссылка

Источник: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30859

Угроза жизни или резус-фактор плода

Особенности определения резус-фактора и пола плода по материнской крови методом ПЦР, кому показан и когда его можно проводить?

Здравствуйте, дорогие читатели! Те из вас, кто часто посещают мой блог, вспомнят, как недавно я писала о подруге, которая столкнулась с вопросом конфликта резус-фактора крови во время беременности. Сейчас ей предстоят дополнительные анализы на резус-фактор плода. Подруга волнуется и злится на неопределенность. Я же решила еще раз коснуться этой темы.

Основные резус-факты

Итак, нам известно, что по резус-фактору кровь может быть положительной или отрицательной. Это означает, что у части людей в составе крови есть антиген D, а у части (меньшей в количественном смысле) — нет. Для жизни отрицательный фактор никаких сложностей не представляет. За исключением случаев, когда речь идет о переливании крови и беременности и родах у женщин.

Если у матери будущего ребенка отрицательный резус-фактор, а от отца он наследует положительный, возможен конфликт и гемолитические проблемы у плода и новорожденного. Гемолитическая анемия, «желтушка» новорожденных, отечность плода и некоторые другие осложнения, — все это корректируется медицинскими методами, но риски серьезного вреда для ребенка есть.

Одним из главных способов профилактики осложнений является вакцинация матери иммуноглобулиновым препаратом. Эта прививка делается или до, или во время, или сразу после беременности. Она позволяет предотвратить процесс, при котором кровь матери борется с клетками крови ребенка, считая их враждебными.

А будет ли конфликт?

Однако прежде, чем волноваться и принимать конкретные меры по профилактике конфликта резус-факторов, разумно выяснить, каковы риски его возникновения.

Сегодня мы можем не просто «прикидывать», с помощью генеалогических предположений, насколько силен положительный ген, который может унаследовать ребенок, а провести конкретный анализ с максимально достоверным результатом.

Способов определить резус-фактор плода существует несколько. Какой из них применить, должен решить врач, на основании состояния здоровья плода и анализов крови будущей мамы. Методы определения бывают инвазивными (проникающими сквозь естественные оболочки организма) и неинвазивными.

Методы исследования резус-фактора плода

Инвазивные методы носят названия амниоцентез и кордоцентез. При первом проводится исследование ворсин плаценты после прокола плодного пузыря и забора околоплодных вод. При кордоцентезе забор крови производится из пуповины, тем же способом, которым, при необходимости, проводится переливание крови еще не родившемуся малышу.

Риск осложнений с последующим прерыванием беременности при инвазивных методах — 2-3%. Понятно, почему они назначаются в строго определенных случаях — только когда уровень антител в крови матери достигает соотношения 1:16 и 1:32, соответственно, или если у матери уже были дети, пострадавшие от гемолитической болезни и других последствий конфликта резус-факторов.

Инвазивные методы являются гипер-ответственными, но при этом не всегда дают необходимую точность.

Как же прекрасно, что наука развивается, и у современных будущих мам есть на вооружении и неинвазивная альтернатива! Достоверность данных этого анализа — 99%. Лабораторий, в которых его могут провести, (за сравнительно небольшие деньги, если он проводится на коммерческой основе), достаточно.

Волшебная ПЦР

На первом месяце беременности в крови женщины уже появляется т.н. «фетальная» ДНК — от английского слова «fetal» — плод (другое название — «внеклеточные нуклеиновые кислоты»). Это примерно 3-5% от общего количества внеклеточных ДНК, выделяющихся из плазмы и циркулирующих в крови беременной.

Если в лаборатории выявляют, что ДНК плода содержат фрагменты гена RhD, делается вывод, что у ребенка — положительный резус-фактор.

Название метода неинвазивной диагностики резус-фактора плода известно практически всем современным женщинам — просто обычно аббревиатура «ПЦР» («Полимеразная цепная реакция») связана для нас с анализом на различные инфекции (от ВИЧ до герпеса или молочницы) во время планового гинекологического осмотра.

Материал для ПЦР берут различными способами в зависимости от цели исследования. Для будущей мамы, обеспокоенной возможностью конфликта резус-фактора, это будет просто еще один анализ крови из вены.

Определение пола плода — наука и теория вероятности

С помощью ПЦР также можно определить будущий пол ребенка на ранних сроках. Это необходимо для семей, где есть наследственные заболевания, связанные именно с гендерным фактором (например, гемофилия). Также в случаях необходимости принятия решения о назначении гормональной терапии.

Ранние сроки — это начиная с 8-й недели беременности, когда резус-фактор и половая принадлежность плода на клеточном уровне уже сформировались.

Резус-фактор отца
Резус-фактор материПоложительныйОтрицательный
Положительныйженскийженский
Отрицательныймужскоймужской

Раз уж мы заговорили об определении пола ребенка, покажу заинтересовавшую меня таблицу, по которой можно «погадать» на то, кто у вас будет, мальчик или девочка. Это не совсем гадание, так как доля достоверности в таблице есть.

Скорее, это данные статистики, собранные воедино, за неимением точного научного ответа на вопрос формирования гендера. Проверила по обеим таблицам — у меня все совпало!

Группа крови отца
Группа крови материIIIIIIIV
Iженскиймженскийм
IIмженскиймженский
IIженскийммужскойм
IVмженскийммужской

Дорогие будущие мамы! Раз нам с вами так повезло жить в просвещенное время, а не во времена, когда предсказать что-то действительно можно было только с помощью гаданий и интуиции, давайте этим пользоваться! Следуйте назначениям врача, старайтесь предотвратить возможные проблемы, взвешивайте риски между мерами и бездействием.

Если есть медицинская необходимость — узнайте резус-фактор и пол ребенка по крови матери, сделайте прививку и избавьте себя от неопределенности. Лучше потратить немного денег и времени в начале пути, чем потом все время волноваться за своего будущего ребенка и его здоровье.

Удачи вам и нужных результатов по всем исследованиям!

Источник: https://gemelos-feliz.ru/vse-dlya-mami/beremennost/rezus-faktor-ploda/

ДляЗдоровья
Добавить комментарий